Нестационарная динамика бактериальных популяционных волн. М.А. Цыганов, Г.В. Асланиди, В.Ю. Шахбазян, В.Н. Бикташев, член-корреспондент РАН Г.Р. Иваницкий Предложена математическая модель распространения хемотаксисных бактериальных волн с учетом локального изменения бактериями окружающей среды и представлены результаты как натурных, так и численных экспериментов роста бактериальной колонии. В результате на примере формирования стационарных бактериальных колец предлагается новый механизм структурообразования колоний. Формирование бактериальных популяционных волн на полужидких питательных средах при точечной инокуляции подвижных бактерий связано с явлением хемотаксиса, т.е. способностью бактерий изменять направление движения, избегая одних зон и стремясь переместиться в другие. Такое направленное движение возникает за счет уменьшения частоты кувыркания (тамблинга) и увеличения периода ровного плавания бактерий в сторону более благоприятного для них условия обитания [1]. Частичное подавление частоты тамблинга происходит у бактерий при движении по градиенту аттрактанта. Кроме того бактерии могут сами изменять локальный градиент аттрактанта за счет его потребления. В результате в слабоагаризованной питательной среде формируется хемотаксисная волна. Случаи симметричного распространения бактериальных популяционных волн, когда кольца хемотаксиса сохраняют резко очерченную форму и движутся с постоянной скоростью, зависящей от подвижности бактерий и их хемотаксисных свойств, хорошо описываются математическими моделями, основанными на уравнениях Келлера-Сегеля [2]: ¶b/¶t = k1 g(S)b + DbС2 b - nС( b c (S )СS ) (1) ¶S/¶t = - k2 g(S )b + DbС2 S , где b(x,y,t) - плотность бактерий, S(x,y,t) - концентрация потребляемого бактериями субстрата-аттрактанта, g(S) - удельная скорость роста бактерий, c(S) - функция хемотаксисного ответа, Db и Ds - коэффициенты диффузии бактерий и субстрата, соответственно; n, k1 и k2 - константы. Моделью Келлера-Сегеля и ее некоторыми модификациями удалось описать формирование и распространение хемотаксисных колец Адлера [1] и различные процессы структурообразования в бактериальных колониях при их взаимодействии [3-6]. Было также показано, что бактериальные популяционные волны относятся к особому классу автоволн [3-6]. При некоторых условиях бактериальные популяционные волны могут распространяться в пространстве неравномерно, в результате чего формируются различные типы структур: зерноподобные образования [7-9], ветвистые (фракталоподобные) [10-12], выбросы [3,12], стационарные кольца [13]. Процессы структурообразования в этих случаях уже невозможно описать математической моделью (1) и приходиться для каждого конкретного случая строить новые модели. При математическом моделировании формировании фракталоподобных структур в бактериальных популяциях используются модели типа «клеточный автомат» [10,11], а также модель с бактериальной диффузией, коррелирующей с изменением питательной среды [12]. В работе [13] при исследовании процессов формирования стационарных концентрических колец показано, что обнаруживаются по крайней мере два морфологически различных состояния бактерий: ВФ - вегетативная форма (подвижные клетки) и АФ - анабиотическая форма (агрегаты неделящихся клеток). Предлагаемый в этой работе механизм образования основан на предположении о существовании секретируемого бактериями медиатора, повышенная концентрация которого вблизи клетки служит управляющим сигналом к ее дифференцировке. Предполагается также, что формирование структур происходит только за счет диффузии бактерий, а таксис бактерий в градиентах субстрата и метаболитов, возникающих в процессе роста колонии, не играет существенной роли. В то же время в работах по исследованию формирования зерноподобных структур при росте бактериальных колоний в математической модели, описывающий этот процесс [8,9], основную роль играет таксис бактерий на аттрактант, которым в данном случая является медиатор, выделяемый бактериями [7]. В настоящей работе на примере формирования стационарных бактериальных колец предлагается новый подход. Рассматривается математическая модель распространения хемотаксисных волн с учетом направленного локального изменения бактериями окружающей среды. Эксперименты по исследованию стационарных бактериальных колец проводились следующим образом (детали смотри в подписи к рис.1). В центр чашки Петри, содержащей слабоагаризованную питательную среду (толщина слоя - около 3 мм), инокулировались бактерии. После инокуляции чашки Петри помещались в термостат при температуре 36oС. При определенных условиях и концентрациях агара вокруг центра колонии последовательно образовывались стационарные концентрические кольца (рис.1). В динамике таких колец необходимо выделить три основных этапа: 1) формирование; 2) распространение; 3) остановка. Из центра инокуляции формируется таксисное кольцо, которое распространяется аналогично кольцу Адлера [1], хорошо описываемое системой уравнения Келлера- Сегеля (1) для хемотаксисных волн. Но на определенном радиусе от центра данная бактериальная волна останавливается, образуя стационарное кольцо. Через некоторый промежуток времени из этого кольца вновь формируется популяционная волна с более низкой концентрацией бактерий. По мере распространения этой волны бактериальная плотность ее фронта увеличивается за счет деления бактерий. Далее вновь следует процесс остановки, формирования и распространения волны и т.д. На рис.1 представлен фрагмент фильмограммы роста многокольцевой структуры колонии бактерий E.coli K12: бегущая бактериальная волна (рис.1.1 и 1.2) отмечена стрелкой. На рис.1.3 и 1.4 показана остановка волны и образование очередного стационарного кольца. На рис.1.5 и 1.6 - формирование новой бегущей волны Для объяснения наблюдаемого поведения бактерий необходимо понять причину остановки распространения волны. Такой причиной может быть изменение питательной среды за счет естественного выделения бактериями метаболитов. Известно, что подвижность бактерий, а следовательно, и скорость распространения бактериальных популяционных волн существенно зависят от состояния питательной среды, в которой они находятся, например от pH [14]. В работе [15] исследовано изменение pH среды в ходе распространения как на фронте бактериальной волны, так и позади нее. Можно предположить, что при относительно медленных скоростях распространения бактериальных волн, локальные изменения состояния среды на фронте (за счет выделения метаболитов бактериями и дальнейшей диффузии этих метаболитов) могут существенно влиять непосредственно на состояние бактерий. Другими словами, помимо реакции на градиент субстрата-аттрактанта, бактерии также должны «отслеживать» и другие параметры внешней среды, изменяя свою подвижность, и переходить из подвижного состояния в неподвижное, как показано в работе [13], что и может привести к остановки соответствующего хемотаксисного кольца. Остается следующий вопрос: как после остановки вновь формируется кольцо хемотаксиса? Возможность проникновения бактерий за пределы кольца неблагоприятных условий только за счет диффузии представляется сомнительной, так как в образовавшемся стационарном кольце плотность бактерий достаточно высокая, и в случае наработки ими метаболитов, диффузия метаболитов не позволит выйти бактериям в благоприятную для них зону. Остаются две возможности: а) локальное изменение среды в «благоприятную» сторону; б) адаптация бактерий к новым условиям. В данной работе рассмотрим схему (а). Пусть b и B - концентрация бактерий в двух различных состояниях, где B соответствуют «неподвижному» состоянию, при котором у бактерий хемотаксисный ответ равен нулю, b соответствуют бактериям способным за счет хемотаксиса изменять направления движения, во- первых, по градиенту концентрации субстрата-аттрактанта (s), а, во-вторых, в сторону «оптимальной» по состоянию для них среды. Под «состоянием» среды (переменная h) будем подразумевать некоторую совокупность физических и/или химических ее параметров, (в частности, pH среды), которые меняются вследствие жизнедеятельности бактерий. «Оптимальное» для бактерий состояние среды есть некоторая величина h*. Таким образом, для бактерий оценка состояния среды проводится по величине H=|h - h*|. Переход бактерий из состояния b в B происходит при превышении H некоторой пороговой величины H*. Пусть при этом переходе бактерии выделяют некое вещество p, которое может являться для них субстратом [7]. Будем считать, что при превышении некоторой концентрации p1 бактерии переключаются с потребления субстрата s на p, хемотаксисный ответ бактерий на градиент s становится равным нулю, что эквивалентно переходу b ® B. Кроме этого будем считать, что p способствует изменению питательной среды в благоприятную для бактерий область H, а также участвует во взаимных переходах бактериальных состояниях: b « B. А именно, переход B ® b возможен при одновременном выполнении условий H Ј H* и p < p2 , где p2 < p1. Для реализации такой схемы роста бактериальной колонии предлагается следующая математическая модель: ¶b/¶t = k1 G(s,h)b - ab + k2 bB + DbС2 b - vsС(bСf(s)) - vhС(bСj(h)) (2.1) ¶B/¶t = ab + k2bB + k3F(s,h,p)B + DBС2B (2.2) ¶s / ¶t = - k4 G(s,h)b + DsС2 s , (2.3) ¶p/¶t = k5a b - k6F(s,h,p)B - k7 ph + DpС2 p (2.4) ¶h/¶t = k8 G(s,h) b + k9 F(s,h,p)B - k10 ph + DhС2 h (2.5) где k1G(s,h) - удельная скорость деления бактерий: G(s,h) = g(s)((h), g(s)=s/(s+s1), ((h) = 1 - H/(H+H1), H=|h - h*|; F(s,h,p) = pG(s,h), ( и ( коэффициенты перехода бактерий из b ( B и B( b, соответственно: 1, если H > H* или p > p1 1, если H ( H* и p < p2 , ( p2 < p1 ) ( = ( (3.1), ( = ( (3.2); 0 - в остальных случаях 0 - в остальных случаях; члены в уравнении (2.1) vs((b(f(s)) и vh((b(((h)) описывают, соответственно, таксис бактерий на субстрат s и в направлении "благоприятной" среды; f(s) рассматривалась для двух типов таксисного закона [2-4]: f(s)=g(s) и f(s)=s; Di - соответствующие коэффициенты диффузии; ki, H1, H*, h*, s1, p 1, p 2, vs, vh - константы. При формулировке этой модели мы сделали ряд предположений, не основанных напрямую на экспериментальных данных. Здесь следует подчеркнуть, что наша цель в данной работе - лишь показать принципиальную возможность объяснения явления остановки и возобновления бактериальных фронтов на основе взаимопереходов состояний бактерий b ( B . Численные эксперименты на математической модели (2) проводились для одномерного и двумерного случаев по схеме Эйлера; в двумерном случае с учетом вклада (0.7) диагональных элементов. Шаги по пространству и времени были, соответственно, (x=(y=0.5, (t=0.005. На границах выполнялось условие непроницаемости Неймана. Начальные значения для переменных B, s, h, p по всей среде принимались следующими: B0=0, s0 =0.5, h0=0.1, p0 =0. Для переменной b ее начальное значение b0=0 везде кроме области инокуляции, где b0=0.3 при 0